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【新品发布】DdPCR试剂盒开发与验证
点击次数:83 发布时间:2020-01-13

PCR技术从1983年开始依次经历普通PCR,Real-Time PCR和dPCR,现如今dPCR技术的发展就像1990年代末的Real-Time PCR发展一样,发展迅猛。

 

下面我们以DdPCR为例,讨论dPCR技术。

 

什么是DdPCR? 有什么技术特征?有哪些方面的应用?

DdPCR全称Droplet Digital PCR,引用bio-rad的描述为Droplet Digital PCR technology is a digital PCR method utilizing a water-oil emulsion droplet system. Droplets are formed in a water-oil emulsion to form the partitions that separate the template DNA molecules. The droplets serve essentially the same function as individual test tubes or wells in a plate in which the PCR reaction takes place, albeit in a much smaller format. The massive sample partitioning is a key aspect of the ddPCR technique.

 

从基本原理我们不难看出,DdPCR最大的优点是绝对定量,表现为:

 

  • 绝对定量 -ddPCR技术无需输入标准曲线即可提供每个输入样品的目标DNA拷贝的绝对计数,使该技术非常适合目标DNA的测量,病毒载量分析和微生物定量;
  • 无与伦比的精确度 – ddPCR提供的大量样品分配功能可以可靠地测量样品中靶DNA序列拷贝数的微小差异;
  • 提高信噪比 -稀释高拷贝模板和背景,有效富集靶标阳性分区中的模板浓度,从而可以灵敏地检测稀有靶标,并实现±10%的定量精度,灵敏度可达单个核酸分子,检测限低至0.001%;
  • 消除PCR偏差 -消除qPCR的扩增效率依赖性,降低了错误率,可检测到小的(1.2倍)差异,这里需要指出的是;
  • 降低了耗材成本 -反应体积在皮升至纳升的范围内,减少了试剂的使用和每个数据点所需的样品量,对于珍贵的样品尤其适用;
  • 降低设备成本 -基于乳液的反应系统意味着PCR反应可以在标准的热循环仪中进行,而无需复杂的芯片或微流体。
  • 出色的分区 -ddPCR技术每20 µl样品可产生20,000个液滴,在96孔板上可进行近200万个分区PCR反应,分区数量越多,精度越高。

 

DdPCR技术有很多方面的应用,我们按照发表文章的领域,可以简单划分为: 

 

结合肿瘤领域,我们一般与之相关的有4个领域的应用:

  • 检测Gene Expression,主要是检测mRNA的定量分析;
  • 检测Mutation(SNV和Indel),可以检测拷贝数,也可以检测比率;
  • 检测CNV(拷贝数变异分析),相对定量;
  • 检测Fusion,可以检测拷贝数,也可以检测比率;

 

同样的,科佰生物也针对这4个应用开发对应的检测试剂盒,配套科佰生物的参考品,对试剂盒做性能评价,如下我们以EGFR T790M为例:

 

实验一:灵敏度测试

待测样本:不同%AF的EGFR T790M的标准品,依次为5%,2%,1%,0.5%,0.2%,0.1%。

首先我们选择50%的EGFR T790M标准品(CBP10402),该标准品是通过基因编辑,二等位基因,CN=2,编辑一条为mutation,一条为WT,经过理论值计算、Sanger测序、Bio-Rad DdPCR试剂盒(Assay ID: dHsaCP2000019)共同验证,确认为50%的频率。然后使用对应的host cell的gDNA,按照质量比(Qubit 3.0 三次定量取平均)有限稀释到5%,2%,1%,0.5%,0.2%,0.1%,每个样本准备3个重复,合计18个样本同一次实验检测对应的频率。

对应的数据为:

 

由以上数据可见,EGFR T790M检测体系,对于0.1%都是能检出,且符合标准,但是波动比较大。另外实验过程中,我们发现虽然DdPCR理论上可以生成20000个液滴,但是多次实验表明,实际生成往往是低于这个数值,平均约为8000-10000个,液滴数越少,因此低于0.1%的频率可能会波动很大,影响真实值判断。

 

实验二:重复性测试

待测样本:取1%和0.1%的EGFR T790M的标准品,分成8份,每份上样10ng,一次实验完成对应的定标。

对应的数据为:

 

由以上数据可见,EGFR T790M检测体系是稳定可重复的,全部能检出。

同样的我们也对Gene Expression(mRNA)、CNV和Fusion开发了部分DdPCR试剂盒,利用科佰特有的标准品产品,我们做了性能评价,陆续上线了多款产品,如下是我们已经上线的DdPCR探针、引物的清单,全部在QX200上验证过:

更多的DdPCR产品可以选择科佰生物开发定制,我们不仅可以开发定制探针、引物,我们还有标准品用于验证体系性能评价。

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